…関するレビュー論文。顕微鏡のセットアップも楽しくて、ついつい後回しになってしまっていたが、ようやくドラフトを書き上げた。あとで何人かに送って、意見をもらうとしよう。FRETは、原理は簡単なのだが、定量的な測定は結構難しい。蛍光寿命測定、蛍光異方性測定などの測定テクニックも含めて、データをどう解釈するかまで持っていけるとよいな、と思う。もう少し引用する文献をきちんと整理しなければならないな。余計な論文はなるべく引用しないようにしなければいかんし。夏にMBLの神経生物学コース*1…

…特に口をださずとも、顕微鏡をつかいこなし実験をやっていた。大学は、すでに夏休み。去年着たときは、夏休みに学科の人の数が少なくて驚いたものだ。やっぱり南部はみんなのんびりしているなあ、と思ったが。。今年の夏は、サマーＳｔｕｄｅｎｔ（学部生）を受け入れているが、かれらはそもそもこの時期意外にはほとんど実験できないから、夏休みこそはりきって実験をする。それがラボ全体の生産性を上げている感じがする。来月日本に1時帰国している間、ラボがどうなるのか、ちょっと心配だ。それまでに、みんなに…

…験がないのでわからないが。。。本日もラボは顕微鏡作りが中心。はやく部品が全部そろわないかなー。午前中には、同僚のスリの奥さんのアピタが遊びにきた。彼女はもうすぐメリーランド州立大学でラボを持つ予定。今後のラボの計画についていろいろ熱心に聞いていた。彼女も生物物理出身で光学のテクニックに興味があり、話がよくあう。今後の共同研究の可能性も含めてかなり盛り上がった。夜、となりのNegiさんが煮物をつくって持ってきてくれた。いつもながら、完成度の高さにあきれつつ、ありがたくいただく。

…はかなり余裕がある。顕微鏡作りは、全部そろうまで待つのではなく、できるところからどんどん組み立てていくとよい。なぜなら、作ってみると買い忘れた部品が必ずでてくるので、一気に終わらせることは、どちらにしろできないのだ。それに前回作ったときに2つ買ったのに、どこかに無くなってしまったような小さい部品も結構ある。それにしても大勢で作し、自分も何をすればよいかよくわかっているので、今回は早い。ずいぶんと出来上がってきたな。それにしても、家族が日本に帰るまではグラントでいそがしく、時間…

…ルをもっていき、その顕微鏡技術で見えそうな現象を試してみる。そして。。。あまりにもあっさりと出た結果の美しさに、思わず唖然としてしまった。これは、世界を変えるかも。。。 この話は、もう論文にまとめることになり、今日ドラフトが送られてきた。１日の実験で論文にしてしまうあたりは文化の違いを感じる。。。もちろんその日は少なくとも再現性があり大変Convincingな実験ではあるが。。テクニックの紹介が中心の論文だからいいんかな？。ということで、わたしのデュークでの最初の原著論文はコ…

ふむ。書いた内容が消えてしまった。はてなダイアリーは、こういうことがほとんどないのがいいなあ、と思っていたのだが、仕組みが変わってしまったのだろうか？まあともかく、2代目をつくるわけだよ。まずは、いろいろ買い物をする。光学部品を買い、高額部品の見積もりをとる。最初に買ったときに備品はほとんど2個ずつ買ってあるが、電気生理用アンプと電極マニピュレータは買っていない。そのほか、レーザーをスキャンするスキャンヘッドを予備にもう１つ買っておくことにする。壊れたときに待たなければならな…

…ボも人口が増える予定なので、２台目の顕微鏡を作ることに決定。グラント書きの合間をぬって、足りないものを見回り、買い物リストを作り始める。目標としては、６月に入ってから２週間くらいで作り上げることか。ものはだいたい揃ってるし、やりはじめたら早いはず。今回は、手伝ってくれる人も沢山いる。サマーStudentにも、いろいろやってもらう予定。簡単な半田付けや、アルミ版＋アングルでの箱作り、スプレー塗装など、自由研究の工作みたいなところもあるので、きっと楽しんでもらえるのではないかな。

…中に１時間かに一回、顕微鏡コントロール用のコンピューターがクラッシュしていた。有名なブルースクリーンではなく、突然画面が真っ白になったのちに真っ黒になるというかなり精神的にもダメージが大きいクラッシュのしかた。よいデータがとれるときに限っておこる。省電力設定やビデオアクセラレータかと思ったが、オフにしてもまだクラッシュする。ＰＣＩボード4枚もいれているから、ドライバーまわりかな、と思っていたのだが。。。いろいろいじっていると、レーザー制御用のソフト（レーザーに添付されている）…

顕微鏡は、うまく動いている。写真はポスドクによるうちのラボ初のスパインの蛍光寿命測定！調子にのって、今度のレビューでこの写真つかうかな。

少し書き物を一段落。少し寝かせるとともに、他の人のコメントを待つことにする。将来の実験計画モード、および実験モード。今日はGlutamate uncagingもきちんと動き始め、顕微鏡はフル稼働である。なんで今までうまくいかなかったのか、ようやくわかった。培養スライスは、ここ数週間、グラントの予備データ用に沢山作ってもらっているが、どんどんよくなっている。ＤＮＡの導入も、カレルラボでも見たことないほど入るようになった。だいぶラボも軌道に乗ってきたかな。

…タクトしてきた。私は顕微鏡・物理・神経の言葉を理解できるので、神経と彼らのレーザー技術をつなげる役割を担うことになったわけだ。レーザーラボにサンプルをもっていき、その顕微鏡技術で見えそうな現象を試してみる。そして。。。あまりにもあっさりと出た結果の美しさに、思わず唖然としてしまった。これは、世界を変えるかも。。。今後も共同して、ぜひとも、ＸＸＸとか○○○とか、みてみたいなー、と思ったのであった。一緒に実験をやったポスドク＋学生も、はじめて神経細胞を見て、一回目にでてしまった結…

…装置は、やってればいつかは完成するものなのだが。。。電気生理のセットアップもだいぶ終わる。ステージの位置などをごちゃごちゃと調整。ＮＩＨのグラントのプロポーザルは、6月1日が締め切りだが、5月1日を目標に書くことにする。そこで人にみせて、1と月の間に軌道修正が必要なら軌道修正する、という感じでいこう。そろそろ、本気で書くモードにならないといけない。顕微鏡2号は、グラントのあとかなあ。まったく同じ顕微鏡を作るのでは芸がないから、少し違う仕掛けをいれてみたい。さて、どうなるかな。

…じが到着し、ついに、顕微鏡第一号完成！培養脳スライスも意外にできがよいことが判明。先日試した、ジーンガンによるＤＮＡの導入はうまくいかず、グリア細胞ばかりに入ってしまったが。。これも1−2週間条件をつめれば、うまく神経細胞に入るようになるであろう。グリアだけでも、はじめて培養脳スライスに入った蛍光色素は、それなりに感動する。明日から、電気生理を本格的に立ち上げる予定。それに向けて、脳スライスも、もう少したくさん作ってもらうことにする。今月中に最初のデータをめざすぞ！！そして6…

…の構造を可視化できる顕微鏡がのっている。技術そのものは、すでに数年前からあるが、実際の細胞イメージングに応用されたのは初めてであろう。この責任著者のＨｅｌｌさんは、ある意味、とても物理やさんというか光学やさんで、いままで生物に興味をもっているとは思えなかったんだけど、突然バイオロジカルな問題にアタックしはじめたのが、ちょっとおどろき。ちょっと興奮してしまったので、書き留めておこう。蛍光顕微鏡は、細胞イメージングでは素晴らしい威力を発揮する。電子顕微鏡などと違って、生きた細胞を…

…）をつけ、2光子蛍光顕微鏡がフル装備となった。赤・緑蛍光用のＰＭＴが、対物側２つとコンデンサー側２つがつき、それぞれのシグナルを足す仕組みになっている。電流増幅器で電流を電圧に変える前に２つのシグナルをあわせてしまえばよいだけである。コンデンサー側は、予定通り対物側の2.5倍ほどのシグナルが取れるようになった。対物の開口数（ＮＡ）が0.9、コンデンサーのＮＡが1.4だから、ＮＡの比の２乗ということで、計算上もほぼ正しい。これまでは対物側でしか蛍光を検出していなかったから、それ…

…、７桁ドル近くなり、顕微鏡のためにと特別たくさんもらったスタートアップ資金を使い切る勢いで使っていたことがわかった。まあ、もともとスタートアップ資金のほとんどを顕微鏡につぎ込むつもりだったのだから、これでよいわけだが。。。。ちょと仕様が贅沢すぎたかな。なにしろ、全自動の最新フェムトセカンドレーザーが2台という。。。ということで、プライベートグラントで食いつないでいる状態。たくさん出した７月スタートのプライベートグラントがもう１つか２つ降りなければ、財政的にも少し厳しい雰囲気に…

…ドは物理だし、共同研究の可能性もふくめて、物理学科の人と付き合うのは、面白いだろう。また、物理学科の学生を取れる機会にもなる。新しい顕微鏡技術の開発などは、物理学科の学生と一緒に研究できたら、プラスになることも多いだろう。もちろん、授業などで協力する必要はあるので時間をよりとられる、ということはあるだろうが。。。ＢＷＦのキャリアミーティングでは、プラスとマイナスが同じくらいだ、という意見も聞いたことがある。しかしまあ、とりあえずいろいろな可能性を考えておくのはよいことだろう。

…あまり単純化すると、今度は現実を反映しなくなる。このへんのバランスがセンスのいるところなのかな？複雑さの極限としては、M-Cellのような、デンドライトやスパインの中の分子を1個1個ブラウン運動させてシミュレートするプログラムなどがある。でも、このプログラムである興味深い現象をコンピューターで再現できたときに、それを「わかった」という気持ちになるのかどうかは微妙だという気がする。その後、神経学科への学生リクルートのインタビューと、顕微鏡のセットアップ。溶液還流システムが動く。

…うまくいっていない。顕微鏡のほうは大丈夫なのかなあと思って、Ｒａｓとその結合タンパクの相互作用を測ってみると、ばちっときれいにシグナルがでる（こちらの論文に出したやつね。）どうもＲａｓは、一番簡単に動くものの１つだったようだ。そしてＲａｓ系でも、ちょっと凝ったことをやろうとすると、なかなか難しい。よく考えてみたら、Ｒａｓ測定がきちんと動くようになるまで、何ヶ月もかかったのだから、他の測定が簡単にいくわけないのかもしれない。まあ、一歩一歩やっていくしかないかな。最近アナウンスさ…

…のだがな。そのほか、顕微鏡のコンデンサー側の光検出の光学系を検討する。カレル研にいるときから、効率よく光を検出できないので悩んでいたのだ。とりあえずフィルターを全部ぬきとり、赤いレーザーを顕微鏡にいれてミラーをスキャンさせ、あちこちの面でのスキャンの大きさを調べていく。見ていくうちに、光学系の問題がはっきりわかった。結局レンズを置く最適の位置は１箇所しかなく、その場所にレンズをおくことは不可能だということがわかったのだ。不可能ではこまるので、結局レンズを２枚つかってごまかす方…

…めた光を普通の２光子顕微鏡として使うシステムが完成する。２光子顕微鏡の面白いところは、上下左右どこにいった蛍光を検出しても像になるところだ。レーザーが集光したところでしか蛍光ができず、そのレーザースポットをスキャンしていくことによって像をつくる。だから、他の顕微鏡とちがって、「どこで」光を検出するかはあまり関係ないことになる。本日は、箱を組み立て、２色イメージングのためのフィルター、ダイクロイックミラーなどをとりつけて、いちおう終了。あしたは本当の細胞で２色イメージングを試す…

さて、顕微鏡の組立て終了に向けて、カスタム部品のラストスパートに入っている模様なのだが、出来るたびに、少しずつ問題がでてくる。特に光を２つに分けるためのキューブボックスは、部品が８つもあって、穴も全部で３０以上ある。これだけあると、穴が少しずれているとか、そういう微妙な問題がいくつか出てくる。この部品は、自分で図面を引いていなくて、ＣＡＤでないファイルしか残っていないために問題が多いみたい。長さを入れ忘れたとか、間違っていた、というのもあって、なかなか難しい。出来た！と思って…

…がら、完成の近づいた顕微鏡で蛍光寿命測定をやる。今日は初めて神経芽細胞腫の細胞を使ってみる。よく使うＨＥＫ２９３細胞よりは、神経に近いから神経に進む前の第一ステップとしてテスト用に使おうというわけだ。比較的簡単に飼えるのがよい。しかしＨＥＫ２９３細胞と違って、なかなかＤＮＡが入りにくいようで、光っている細胞はあまりない。とにかくやっとみつけて、カルシウム流入からはじまるシグナリングに重要な２つのたんぱく質の相互作用を初めて測ってみる。残念。脱分極させてカルシウムチャンネルを活…

…終了か。今回の2光子顕微鏡のレビューは、１つ１つのシナプスの化学反応の測定の技術についてかなりの行数をさいている。シナプスは、それぞれのシナプスの反応は独立に制御されているので、１つ１つのシナプスの化学反応イメージング及びコントロールが神経科学の前進に重要なわけだ。今回の論文では、特に最近普及してきている、蛍光寿命測定と光化学反応による化学反応の局在化技術の紹介がメインとなっている。蛍光寿命測定は、たんぱく質の結合を細胞内で直接みることができる仕掛けであり、この前のわたしのN…

…た２光子蛍光寿命測定顕微鏡で、いよいよ細胞に発現させたたんぱく質の相互作用を測定しはじめる。Ras以外にも、３種類ほどのたんぱく質相互作用を見てみる。この研究室で、はじめての蛍光寿命測定のデータだ。半年かけてようやくここまででたどり着たか、と感慨も深い。結果は１勝１敗１引き分け。１つは美しく活性化、不活性化がみえる。もう１つはまったく変化なし。３つめは、ちょっと神経で使うには変化が小さすぎる雰囲気。これもいろいろOptimizeすれば結構みえるようになるだろう。１勝のやつは、…

…求することもあるし、顕微鏡関係の消耗品をいれることもある。予算はなるべく消耗品にしておくとよい。さて、グラントを提出するときに、普通は書かなければならないものの１つに、他のグラントの内容を書く、「Other support」のページがある。ここに、申請中＋すでに獲得したグラントのプログラムの概要とか、どれくらいの時間を使う予定か（エフォト）とかを書く。給料＝エフォトなので、PIの給料サポートがない予算は、そういうふうに書いておく。このページ、グラントを毎月のように出すから、ど…

蛍光寿命装置*1のソフト＋ハードの整備を再び始める。どうもWindowsXP+新しいMatlab+新しいDynamic link library（DLL)では、昔のソフトは動かない。カレル研にいたときに作ったソフトは、Windows2000でDLLもMatlabも１つづつバージョンが古い。原因不明のメモリーエラー、というか原因はメモリーエラーなのだが。。。で、すぐに飛んでしまう。マニュアルで見る限りはDLLのFunctionのフォーマットに変化はないように見えるのだが。。。で…

…ルが「神経」に２光子顕微鏡に関するレビューに招待されて、私も一緒に書かないか？と誘われたので、今書いているところである。基本的にはセクションわけをして、任されたところを書く、という雰囲気でやっている。カレルがアウトラインを作って進めているので、カレルより大分楽にやってるんだろう。これまでの文献をきちんともれなくレビューしておくなど、なかなか難しいものだ。１つ書き物が終わると次がまっているというサイクルはなかなか疲れるが、これが仕事なんだなー、と体で理解しつつある。それにしても…

注文した細かい電子部品がDigikeyから届いたので、今日は蛍光寿命測定のセットアップを終わらせようと意気揚々。まずはレーザーのパルスをとるための高速ダイオード（分解能１ナノセカンド。40ドルもするぞ）をセットアップ。単に抵抗とキャパシターをつなげて１２V電圧をかけるだけ。でも動かない。なんでだろうと思ってよく見てみたら、一部に間違え発見、つなげなおす。でも動かない。Photodiodeは、電源なしでも、たんに両方のはじをわに口でもって光に照らして抵抗を通せば結構な電圧になる…

…ということもあって、顕微鏡のセットアップ終了の目標を今月末に設定する。電気生理のためのセットアップもする。カスタム部品も、マシナーと相談して、どうやら来週くらいにはかなりの部分を終わらせられる、という運びになった。それから、部屋をちょっとオーガナイズしなおす。顕微鏡の横にあるテーブルは、顕微鏡部品とねじと電子部品でぐちゃぐちゃ。これを整理する。長い間ばらばらのままほうってあった抵抗とかキャパシターとかのこまごましたものも小さな引き出しにいれる。顕微鏡室は、スペースがあまりまく…