Experiments
ふむー。なぜか突然のようにデータがとれるようになる。ここまでの経緯は以下のようになる。 一回目の実験でうまくいき、データがとれる。 その後何回やっても記録できるところまでいかない。 おまじないをするとうまくいくことがわかる。 二日に1個くらいの…
現在の仕事をDukeに移る前になんとか終わらせるために、最近ものすごく集中して実験しているので、疲れる。3時間近く安定して電気生理ができるようになり、データがたくさんとれるようになった。しかし、どうも一日の終わりのほうによいデータが取れはじめる…
ジーンガンとよばれる手法では、金粒子にDNAをまぶして細胞に銃で打ち込むことによって、DNAを細胞にいれることができる。この金粒子DNAは水に弱いことになっているので、これを作るときに最終的に100％エタノールに置換してから乾かす。で、この100％エタノ…
ふーん、こういうこともあるんだ。今日は培養脳スライスの調子が悪くて、36枚中たった2枚しかまともなスライスがなかった。で、その中で２つだけ目的のGFPつきたんぱく質を発現している細胞があったのだが、それで美しいデータがとれてしまった。だいたいい…
Takashiさんと、「1回目の実験はうまくいく」法則について話していた。Takashiさんが今やっている実験でも、最初のあの美しいデータはなんだったんだろう？というような事が起こっているそうだ。彼の昔のボスも似たようなことを言っているらしく、論文の図に…
書こうと思って寝てしまったのを弘子がアップロードしてしまった。何を書こうと思ったんだろう？（1/30記す）
昔から不思議に思っていることなのだが、ある多少トリッキーな実験を計画して、うまくいくかなー、と思って始めると、最初の実験は非常にうまくいってデータがとれる。ところが、「よーし、どんどんデータをとるぞ」と思って、もう一回やると、もううまくい…
コールドスプリングハーバーを去るまで、あと5ヶ月。時間がなーい。ということで今日は朝から気合をいれて実験をするが、データとれず。昨日から、ひさしぶりに電気生理＋イメージングをはじめたのだが、まだ感覚がいまいちだ。昨日はいいデータがとれたのに…
今日は、とても変な結果がでた。あるion channelをブロックすると、なぜかRas活性が上がる。なんでだろう? それにしても、どのタンパク質も他のタンパク質と何らかの相互作用をしていて、ネットワークみたいになってるのだから、どっかいじったら、全体が変…
Two days after transfection, I found a lot more neurons expressing GFP-protein! The expression seems slower than I thought. I will try to take nice images for my poster presentation at BWF meeting.It's 4:00am. I am still trying .... Probab…
Using particle mediated gene-transfer, I transfectedneurons with new constructs yesterday. I checked the transfectionefficiency this morning, only finding a few cells in 3 slices transfected. For some reasons, gene-gun transfection does no…
今日は、こっそりと、独立したときにやろうかな、と考えてる実験をしてみる。これがすげ−うまくいってしまった。どうしよう。本気にうちこめば、２−３ヶ月で論文書けそうだが。。。。。やっぱり独立してから論文にしよう。
Cerulean decay curve is not single exp, at least in my hand.
最近、笑えるconstructを作ってみたんだが、これが以外と使えるんだな。安定性に難があるが、まあなんとかなるかな。
やっぱりきちんと最適化しなきゃだめだねえ。N末につけたほうがいいなんて思いもしなかったよ。
やったー。ここ数ヶ月の難問、ついに解決！！さあばんばんデータとるぞー！！
More mGFP quantifications... Make bullet and shoot (mGFP ones) Western
Cloning mGFP fusions.
Maybe mGFP or mYFP is better than others.
あーあ。うまくいかね。なんでmaxi prep失敗するかね。来週は、University of Washingtonへ、面接だしね。面接があると、ぜんぜん実験がすすまないんだよね。
Maxi Plate cells Check expression.
Making constructs. Western blotting. KCl 90mM works. No effects with SP.
RBD-binding assay (Slices). SP/non-SP.Making constructs.
Lifetime of Venus = 3.0 ns @25 degrees. Made some venus constructs. H, K, mutants. SECFP/Venus : more than 60% folding. Need SECFP only.
Trasfect to Hela cells with Raichu seriese (gifted by Matsuda M.). How bright is the SECFP ? Transfection did not work well.
Hela Cell experiments. K works better than H !!
Transfect Hela Cell with Sensors. Measure slices Very funny result. Some delayed activity was observed. Maybe cAMP dependent pathway ?
I looked for optimum conditions for the Ras sensor using Hela cell. It looks like Hela cell is not happy in Tyrode solution.
うまくいかねーよ。1:0.5 pPW constructではだめみたい。1:4でやりなおすべし？Basal activityが高いのかなあ。
